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周末将至，佳作来袭！本研究获得一种新的葡萄球菌噬菌体CSA13并对其生理、基因组学和生物信息学特性进行了研究其研究思路与美格基因单菌基因组分析流程相似（详情点这里）

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CharacterizationandGenomeAnalysisofStaphylococcusaureusPodovirusCSA13andItsAnti-BiofilmCapacity

金黄色葡萄球菌PodovirusCSA13的特性、基因组分析及其抗生物膜的能力

作者：YoyeonCha1,2,?,JihwanChun1,2,3,?,BokyungSon1,2,4andSangryeolRyu1,2,3,4,*

期刊：Viruses

时间：.1

影响因子:3.

DOI：10./v

研究背景

人类感染金黄色葡萄球菌可能会危及生命，金黄色葡萄球菌能在生物和非生物表面形成生物膜，这是其在临床和食品环境中难以消灭的主要原因之一。噬菌体被认为是治疗耐多药细菌和生物膜相关感染的替代抗菌剂，金黄色葡萄球菌噬菌体主要为双链DNA噬菌体，强毒噬菌体，其中大部分属于长尾噬菌体科（Siphoviridae），少数属于短尾噬菌体科（Podoviridae）和肌尾噬菌体科（Myoviridae）。本研究从一只鸡体内分离得到一种新的葡萄球菌噬菌体CSA13，并对其生理、基因组学和生物信息学特性进行了研究。

实验结果

1、金黄色葡萄球菌噬菌体CSA13的分离及生理特性

金黄色葡萄球菌感染噬菌体CSA13是从一只鸡体内分离得到的。透射电子显微镜(TEM)显示，噬菌体CSA13具有一个40纳米的二十面体头部和一个短的、不收缩的尾巴（图1A），这表明噬菌体CSA13属于短尾噬菌体科。为了确定噬菌体CSA13隐蔽期、潜伏期时长和爆发期大小，对宿主菌株进行生长曲线分析（图1B），确定隐蔽期和潜伏期分别为15分钟和20分钟，爆发期大小约为PFU/被感染细胞，相对于其他典型的金黄色葡萄球菌噬菌体而言较高。为了确定噬菌体CSA13的抑制活性，进行了细菌生长抑制试验（图1C），在MOI为1.0的情况下，金黄色葡萄球菌的生长抑制持续了23小时。

图1金黄色葡萄球菌感染噬菌体CSA13的一般特征

2、噬菌体CSA13的受体分析

已知金黄色葡萄球菌的肽聚糖锚定壁酸（WTA）是噬菌体的受体。对CSA13基因组进行BLAST分析，发现CSA13基因编码的假定受体结合蛋白（RBP），并将其氨基酸序列与金黄色葡萄球菌噬菌体S和S24-1的RBP序列进行比较。结果表明，CSA13的假定RBP和S24-1的RBP具有较高的序列覆盖率(95%)和同源性(97%)。根据噬菌斑可知CSA13可感染含WTA的金黄色葡萄球菌（图2A），不可感染WTA缺失菌株（S.aureus(RNDtagO)）（图2B），通过将菌株与tagO基因互补，恢复了对噬菌体的敏感性（图2C）。因此，可确定WTA是CSA13感染金黄色葡萄球菌的受体。

图2金黄色葡萄球菌感染噬菌体CSA13受体实验

3、噬菌体CSA13的寄主范围

利用15株实验室分离株和8株额外的革兰氏阳性菌株测定金黄色葡萄球菌噬菌体CSA13的抗菌谱（表1）。结果表明CSA13选择性感染金黄色葡萄球菌菌株。13种金黄色葡萄球菌型菌株（包括MRSA菌株）中的11种以及15株实验室分离金黄色葡萄球菌株均被CSA13感染。

表1噬菌体CSA13的抗菌谱

4、噬菌体CSA13的生物膜还原效果

采用结晶紫染色法观察噬菌体CSA13对葡萄球菌生物膜的抑制作用。金黄色葡萄球菌CCARM(图3A)和金黄色葡萄球菌Newman(图3B)形成的生物膜被噬菌体CSA13以PFU依赖方式成功去除。用PFU/mL的CSA13处理24h后，金黄色葡萄球菌CCARM和金黄色葡萄球菌Newman的生物膜质量分别下降了86.5%和56%。当剂量增加到PFU/mL时，CCARM的生物膜去除率为93.4%，Newman的生物膜去除率为78.5%，而金黄色葡萄球菌CCARM菌株的生物膜形成能力比金黄色葡萄球菌Newman强约40%。

图3用噬菌体CSA13去除96孔聚苯乙烯微板上生长24h的生物膜。

5、噬菌体CSA13的基因组分析

通过全基因组测序揭示噬菌体CSA13的基因组特征。CSA13是一种双链DNA(dsDNA)病毒，具有17,个碱基对长的线性染色体，两端反向末端重复序列个bp长。基因组平均GC含量为28.97%，包含18个开放阅读框(openreadingframes,ORFs)，未预测到tRNAs

根据COG数据库聚类，将ORFs分为4个功能组:结构组(主衣壳蛋白、领蛋白、尾纤维)、裂解组(N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酶、穴蛋白)、DNA操纵组(DNA聚合酶、ssDNA结合蛋白)和DNA包装组（图4）。

图4噬菌体CSA13的基因组图谱

6、噬菌体CSA13的基因组比较分析

由于噬菌体没有合适的分子标记，本研究对噬菌体CSA13和其他金葡菌噬菌体进行全基因组测序，并结合金葡菌肌尾噬菌体科（Myoviridae）和长尾噬菌体科（Siphoviridae）噬菌体基因组进行分析（图5），由此得到的进化树可以区分出短尾噬菌体科（Podoviridae）与其他科的噬菌体，且大部分的短尾噬菌体科（Podoviridae）是彼此密切相关的。事实证明，尽管大多数短尾噬菌体科不如肌尾噬菌体或长尾噬菌体家族的噬菌体多样，但其与噬菌体CSA13的相似性最高。

图5葡萄球菌噬菌体的系统发育树

从葡萄球菌短尾噬菌体科的噬菌体基因组结构中可以观察到其相对同源性（图6）。由于葡萄球菌噬菌体的基因组较小(20kbp)，因此预测其基因组的ORF小于30。它们的线性基因组具有高度保守的结构和一些非常独特的特征。尚未鉴定出由溶酶基因和穴蛋白基因组成的典型的人字噬菌体裂解盒。相反，内溶酶出现在染色体上的形态发生基因之间，以酰胺酶为主。此外，在结构基因中，编码衣壳蛋白的基因位于基因组的右端。

图6使用progressiveMauve对葡萄球菌短尾噬菌体科噬菌体基因组进行多重排列

与最近的噬菌体SAP-2相比，噬菌体CSA13具有很强的序列相似性(97%的覆盖率和97%的同一性)。ACT数据显示，预测编码“结构蛋白、小尾蛋白”的phCSA13_与噬菌体SAP-2（ORF15）的差异最为显著（图7）。由于phCSA13_有望充当受体结合蛋白，因此氨基酸序列的一定水平差异可能有助于形成独特的宿主谱。SAP-2的ORF15与S的ORF16非常相似，后者无法结合缺少WTA的β-O-GlcNAc，这一事实表明SAP-2的宿主范围比CSA13窄。

图7用ACT比较分析噬菌体CSA13和噬菌体sap2基因组

结论与亮点

对新发现的噬菌体CSA13的综合研究揭示了其生理和遗传特性。在各种条件下，特别是在宿主细菌形成生物膜的过程中，噬菌体对细菌宿主的抑制作用表明，噬菌体本身可能成为一种有效的生物防治剂。基因组的探索揭示了其作为葡萄球菌足病毒科成员的显著保守结构。尽管有普遍的相似性，但噬菌体CSA13与其他的短尾噬菌体科噬菌体是不同的，进一步的研究将有助于深入了解这些差异是如何导致不同的表型的。