???目前最有效的单克隆抗体纯化方法是亲和层析法，常用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可超过90%杂交瘤细胞株最好保存在-摄氏度、液氮中，保存液中小牛血清的浓度为20%,再加入10%的二甲亚砜。人-鼠嵌合抗体是通过基因工程技术将人Ig的C区与鼠Ig的V区连接，导入细胞内表达制备的抗体????单克隆抗体的特性不包括高度亲和力???克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一。特异性强,纯度高，易于实验室标准化和大量制备。????单克隆抗体只识别单一抗原表位，与抗原结合的强度不如多克隆抗体，故抗原抗体反应的亲和力降低。单克隆抗体只识别单一抗原表位，减少交叉反应，提高实验方法的特异性。单一B克隆表达一种抗原受体并识别一种抗原表位,理论上，4种抗原表位的天然抗原能够活化4种B细胞克隆，产生4种特异性抗体。????直接凝集试验检测颗粒性抗原；间接凝集试验是以抗原致敏载体检测抗体；反向间接凝集试验是以抗体致敏载体检测抗原；间接凝集抑制试验将标本首先加人抗体，然后加入抗原致敏颗粒，如未出现凝集，则说明待测标本中含有相应抗原；协同凝集试验以金黄色葡萄球菌作为载体抗人球蛋白参与的血细胞凝集试验（Coombs试验），是检测抗红细胞不完全抗体的一种的方法。属于一种特殊间接凝集试验，用于检测不完全抗体。其原理是通过抗人球蛋白（第二抗体）与待检抗体结合，待检抗体与红细胞表面抗原结合，形成凝集现象。正向（或反向）间接血凝抑制试验:先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，然后再加入抗原（或抗体）致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝现象。间接血凝试验:固相载体醛化绵羊红细胞协同凝集试验:固相载体金葡菌Elisa:最常用的固相材料聚苯乙烯(蛋白吸附性能好，易于包被;可塑性能强，便于制作成各种形状:透光性能好，便于检测)酶免疫印迹技术:固相载体NC膜即硝酸纤维素膜(蛋白质通过电泳技术分离，再将凝胶中的蛋白区带转印至NC膜上，封闭后进行ELISA检测)为促使凝集现象的出现，可采取以下措施:增加电解质或蛋白质，以降低溶液中离子强度、缩短颗粒间的距离；增加试验溶液的黏滞度，如加入右旋糖酐或葡聚糖等;用胰酶或神经氨酸酶处理，改变细胞表面化学结构；以离心方法克服颗粒间的排斥力等。可溶性抗原与相应抗体在一定条件下形成。组织液、细胞裂解液、血清蛋白、细菌培养液均为可溶性抗原，均可与相应抗体结合形成沉淀反应。????沉淀反应中沉淀线{靠近抗原孔，提示抗体含量大；{靠近抗体孔，提示抗原含量多。抗原抗体在琼脂之内扩散速度受分子量的影响，分子量小的扩散快。由于速度慢者扩散圈小，局部浓度大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。???免疫比浊法的基本原则是在反应体系中保持抗体过量。此时，待测抗原含量与浊度呈正相关。测定密切相关的因素有:抗原抗体的比例、抗体的质量、抗原抗体反应的溶液、增浊剂的应用。校正曲线比较稳定，并可进行抗原过量的检测。???免疫放射分析核素标记在抗体分子上，体系中标记抗体过量，属于非竞争反应。免疫放射分析法标记抗体，放射免疫分析法标记抗原。此外，待测抗原是与过量(放免为限量)抗体结合。???RIA采用PEG沉降结合标记物，然后测定沉淀物，属于PEG沉降分离，原理为标记抗原和非标记抗原对有限量特异性抗体竞争性结合反应，抗原抗体复合物中的放射性强度越大，表明血清中的待测抗原越少。故放射强度与待测抗原浓度呈反比。进行放射免疫分析法必备条件为:放射性核素标记的抗原、标准品、特异抗体、B与F分离、放射性测量仪器。??单向扩散试验有时呈现两重沉淀环的双环现象，这是由于出现了抗原性相同的两个组分，其扩散率不同，形成了内外两重环。????单向扩散试验，向琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。??火箭电泳抗原在含有抗体的凝胶中进行电泳，在电场作用下。抗原向一个方向移动。在移动的过程中，逐步与凝胶中抗体结合而沉淀呈火箭状。火箭峰越高，说明抗原量越多，二者里正相关。因此可用于抗原的定量测定。实际上火箭电泳是定向加速度的单向扩散实验。火箭电泳作为抗原定量只能测定μg/ml以上的含量，如低于此水平則难以形成可见的沉淀峰。?双向扩散试验中估算抗原或抗体的相对含量是根据沉淀线的位置，沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量大；反之，提示抗原含量多。如出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。???双向扩散试验，在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，根据沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体作出定性分析。????抗体特异性鉴定通常釆用双向免疫扩散法，根据沉淀线的特点判断抗体特异性??沉淀反应中抗原有蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。免疫电泳技术中采用的是可溶性抗原，故该技术属于免疫反应中的沉淀反应。Mancini曲线适用于大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果处理；Fahey曲线适用于小分子抗原和短时间（24小时)扩散的结果处理。B0%称最高结合率，指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率NSB%称非特异结合率，指不加抗体时标记抗原与非特异物质的结合率ED50指标准曲线的结合率在50%时对应的抗原的浓度值，它反映标准曲线的稳定性。RER称反应误差体系，是评价RIA整批误差的综合指标。QCS为质控血清。Bq(贝克，放射性活度的国际单位）EC(电子俘获，放射性核素衰变的一种形式Gy(戈瑞，吸收剂量的国际单位）MeV(百万电子伏特，能量单位）T1/2(半衰期，核素衰变单位）。凡属于同一种元素的不同核素.在元素周期表中处于同一位置，质子数相同而中子数不同，称为元素的同位素，以上5种碘元素互为同位素。I(主要发射γ射线，用于单光子显像）I(主要发射β射线，用于正电子显像）I(主要发射γ射线，但能量低，半衰期偏长，故用于放射免疫分析）；I(属于稳定型核素，食盐中碘的主要形式）；I(以发射β射线为主，利用其生物学效应高的特点，主要用于治疗）。在正1价或0价状态，碘原子可以取代酪氨酸分子上羟基邻位的氢原子而标记在蛋白或多肽上。??酶免疫技术是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为nm和nm，一般以ODnm/ODnm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。RZ值为酶纯度的指标，为保证较高的敏感度，RZ大于3.0。???HRP催化TMB呈蓝色，加终止液后最大吸收波长为nm。催化OPD呈橙黄色，加终止液后最大吸收波长为nm。邻苯二胺(OPD)为在ELISA中应用最多的底物。一般采用对硝基苯磷酸酯作为碱性磷酸酶（AP）的底物。在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP低。在ELISA中，β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-β-D半乳糖苷。辣根过氧化物酶催化过氧化氢，H2O2为真正底物，也称为受氢体底物。辣根过氧化物酶(HRP)的常见底物为{邻苯二胺(OPD)→反应后橙黄色{四甲基联苯胺(TMB)→反应后蓝色碱性磷酸酶(AP)的底物为对硝基苯磷酸酯(P-NPP)，反应后为黄色。酶免疫组化技术:HRP催化（二氨基联苯胺）DAB后，生成不溶性底物，在组织中沉积，通过显微镜观察。??HRP由糖蛋白和亚铁血红素组成，其酶的活性基团位于亚铁血红素部分。???双抗体夹心ELISA主要用于检测大分子抗原，以确保待测抗原与固相抗体和酶结合物抗体反应。小分子抗原位点较少。不适合小分子抗原的检测。固相载体包被物是未标记的抗待测抗原的抗体。???间接法主要用于检测抗体，包括病原体抗体或自身抗体。不论哪一种抗体，它们均具有同种型抗原表位，这种表位具有种属特异性，但种属内是相同的。因此，间接法的标记抗体在同一种属内具有通用性。如HIV抗体????由于一步法中固相抗体和酶结合物抗体与待测抗原的反应速率不同，待测抗原含量过高时，容易与酶结合物抗体反应而未能与固相抗体反应，从而导致“钩状效应”。ELISA具备操作简便、无放射性污染等优点。??采用磷酸盐作为包被缓冲液一般选择中性条件，即PH7.2-7.4。能检测出抗体分泌细胞又能检测抗体分泌量的方法是????捕获法：又称反向间接法。主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。竞争法主要用于小分子测定或半抗原测定。临床上常用ELISA法检测抗原特异性免疫复合物。????亲和素有4个相同的亚基，每个亚基均能结合一个生物素分子。1亲和素=＞4生物素。亲和素以结合lμg生物素所需的量作为其活性单位。1mg链霉亲和素的最高活性可达18单位。lmg亲和素的最高活性单位约为13-15。????生物素分子有两个环状结构，其中咪唑酮环是结合生物素分子的主要部位，噻吩环中含有戊酸侧链，侧链末端的羧基是与抗原、抗体或标记物结合的分子结构。ABC复合物中的亲和素（A)与生物素(B)有一定的比例关系，才能产生理想的放大效应。A和HRP-B的浓度比为1:4。为保证抗体分子的生物活性不受影响，每个抗体分子一般标记生物素的数目为3-5。标记反应时，生物素：IgG=2:1(mg/mg)。?????预先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性复合物（ABC)，使用时直接加人反应体系中。本方法简便，比较常用。酶标记生物素分子，与亲和素按一定比例混合，形成亲和素-酶标生物素复合物。为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，在实验中通常针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照和吸收试验等。??免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。????生物素与亲和素之间具有高度亲和力，是抗原抗体反应的1万倍以上，两者结合形成复合物的解离常数很小，赋予BAS的稳定性。????用特异性抗体(第一抗体)标记生物素，加游离亲和素，再加生物素标记的酶，属于直接法BAB反应模式。Ag-(Ab-B)-A-B＊预先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性复合物（ABC)，使用时直接加入反应体系中。Ag-(Ab-B)-AB＊C先让抗原与第一抗体反应，加生物素化第二抗体，再加亲和素标记的酶，属于间接法BA反应模式。Ag-Ab1-(Ab2-B)-A＊纸牌岛
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