今天推送的文章来自于发表在ACSCatalysis上的“AWater-AssistedCatalyticMechanisminGlycosideHydrolasesDemonstratedontheStaphylococcusaureusAutolysinE”，通讯作者为来自于斯洛文尼亚国家化学研究所的JureBori?ek、AndrejPerdih和MarjanaNovi?教授。

来自金黄色葡萄球菌的自溶素E(AutolysinE,AtlE)是一种细胞壁降解酶，是一种潜在的药物靶标。它是糖苷水解酶(GH)成员，通常具有两个催化残基。目前对GH73家族成员的突变研究表明，唯一保守的催化残基是Glu（使用AtlE编号），而第二个催化羧基仍然难以确定。首先作者为了研究是否在酶活性中心存在第二个酸性氨基酸参与催化作用，利用定点突变技术对催化残基Glu以及距其15?内的所有酸性氨基酸和高度保守的Tyr和Ser残基进行了突变研究，并且利用圆二色谱(CD)和差示扫描荧光法(DSF)分别对酶结构的折叠状态和稳定性进行了分析，基于此对突变后酶活性的变化进行了分析。Glu和TyrAla的突变完全消除了酶促活性，Tyr在AcmA和Atl（WM）中的等效位置的Phe和Trp突变保留了酶的功能，表明芳香环而不是羟基对于酶活性至关重要。因此，Tyr似乎有助于底物调节，并且不参与催化作用。Ser和Asp的位置不是绝对保守的。他们的突变体表明酶活性降低了但没有消除。这表明该区域参与底物结合而不参与催化，Asp距离活性位点裂口太远，并不直接参与底物结合。Glu58和Asp的突变体显示部分活性。CD和DSF揭示的AspAla突变体较低的稳定性可能是酶活性较低的原因，而GluAla突变体则表现出近乎野生型的活性。

为了进一步研究相关残基与底物之间的相互作用方式，作者随后针对酶与底物（NAG-NAM）3复合物进行了ns分子动力学模拟（MD）分析。得出的结论是：除了Glu外，没有其他直接参与催化的Glu或Asp残基。其次，对MD轨迹的分析发现了参与底物结合的关键残基。红色显示的Glu58,Glu,Tyr,Ser和Asp残基在MD轨迹中与(NAG-NAM)3底物片段的主链和/或侧链形成至少一个氢键，而蓝色显示的Val,Gly,Gly,Tyr,Gln,Gln和Ala残基在一半的MD时间范围内与底物形成氢键。

在分析过程中，作者观察到催化残基Glu（HE2原子）相对于糖苷氧原子的出现了两个不同的构象：MD模拟的0到14ns和60到ns，两原子间平均距离是2.2?，而在MD模拟中从14到60ns，它们的平均距离是4?。这其中，注意到位于Glu和糖苷氧原子之间的水分子的存在，这也促使作者继续探究这个水分子在催化中的作用。

作者对定点突变试验数据和MD模拟结果的综合分析，提出相对于质子转移到糖苷氧原子的过程提出了两种可能机制：路径A，其中Glu质子直接转移；路径B，其中水分子辅助质子转移。

为了进一步评估两个反应路径中哪个更可能与AtlE催化反应的机理相对应。他们对拟定的反应机理进行了分析，排除了反应过程中水分子对酶-底物复合物结合产生的影响。作者使用CHARMM立场约束距离方法，通过破坏(NAG-NAM)3中糖苷氧和异头碳原子之间的糖苷键，从路径A和B的底物结构生成产物结构。产物结构由两个分子组成：第一个分子包含NAG-3，NAM-2和NAG-1，第二个分子包含NAM+1，NAG+2和NAM+3三糖。在路径A和路径B的底物结构中，产物的第一部分与Gly,Gly,Gln,Ser和Asp形成氢键，而产物的第二部分与Glu58,Glu,Asp和Lys形成氢键。总体而言，与QM/MM反应物结构相比，相互作用模式在产物结构中不会发生很大变化，表明其在底物和产物结构中均具有稳定性。

分析过程作者中未能成功获得稳定的氧碳鎓离子和恶唑啉鎓离子中间体以及诸如TS的恶唑啉鎓离子中间体，所以排除了底物辅助机理。这也表明与其他一些研究系统不同，AtlE不可能形成稳定的中间体。并且排除了除Glu残基以外的其他残基参与催化过程。最终通过QM/MM计算获得的具有类似氧碳鎓离子过渡态的水介导途径的较低能量表明，AtlE水解糖苷键是通过水分子辅助机制进行的。

总结：对酶-对于保留和转化酸/碱机制，质子供体和一般酸碱之间的平均距离分别约为5.5和10?。但是，对于本研究中检测到的GH73家族的酶，羧基之间的距离均大于10?。同时为了避免存在于发夹结构中的酸性氨基酸在催化过程中由于结构变化起到催化活性，对整个催化过程中酶整体结构分析发现在催化过程中发夹结构保持稳定，排除了发夹结构中酸性氨基酸的影响。底物进行MD分析确定了两种催化途径，最终对这两个途径分析表明获得的具有类似氧碳鎓离子过渡态的水介导途径的较低能量。因此，作者认为在此描述的水辅助反应机理是对GH73酶家族催化机理的合理解释。

整理：王胜

文章信息：

DOI：10./acscatal.8b