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金黄色萄球菌(Staphylococcusaureus)(简称金葡菌)是引起细菌性食物中毒的重要食源性致病菌之一。在美国，金葡菌每年大约引起例食物中毒；在我国，20%～25%的细菌性食物中毒病例是由金葡菌引起的。金葡菌的肠毒素(Staphylococcalenterotoxins，SEs)是引发细菌性食物中毒最主要的因素。这些肠毒素可耐高温，不易失活，人体摄入几微克便可导致食物中毒。伴随着抗生素的大量使用，细菌耐药性问题日趋严重，成为全球公共卫生体系面临的一个严峻挑战。研究表明，食品中的耐药菌、耐药基因可以通过食物链传播到人，从而对食品安全和人类健康造成严重危害。食用菌是我国主要的农产品，含有丰富的人体所需的营养物质，广受人们的青睐，然而，在食用菌培植、加工、贮藏、运输、销售等过程中，均可能受到各种微生物的污染。此前，国内外并没有食用菌中金葡菌污染情况等相关调查研究。为全面了解我国市售食用菌中金葡菌的污染情况，广东省微生物研究所/省部共建华南应用微生物国家重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室/广东省微生物应用新技术公共实验室的黄嘉慧、吴诗、张菊梅、吴清平和华南理工大学生物科学与工程学院张峰拟对全国39个城市市售食用菌的金葡菌污染情况进行了系统调查，并在此基础上对分离到的金葡菌进行耐药性和肠毒素基因分析，了解和掌握我国市售食用菌源中金葡菌的遗传特性，希望为预防和控制我国食用菌中金葡菌的污染研究提供借鉴和参考。
1材料与方法
1.1样品采集
年7月至年6月，从全国39个城市的超市和集贸市场采集份食用菌样品，包括份金针菇，份平菇，份香菇，95份杏鲍菇，份其他类型的食用菌样品(见表1)。采样地点覆盖我国大部分的省会城市和直辖市。采样方法严格参考GB.1—[6]中：4“样品的采集规则”进行。所有样品在采集后立即放入无菌采集袋中，并用低温采样箱进行保存，在24h内(依据距离的长短)运回实验室后立即进行样品处理。
1.2试剂与材料
10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、生理盐水、金葡菌显色培养基、营养琼脂(NA)培养基、Muller-Hinton(MH)培养基、脑心浸液营养肉汤(BHI)、冻干血浆，广东环凯微生物有限公司；微球菌、葡萄球菌和相关菌属鉴定试剂盒(比色法)APIStaph，法国梅里埃公司；药敏纸片，英国Oxoid公司；细菌核酸DNA小量提取试剂盒，广州迈宝生物科技有限公司；DreamTaqTMGreenPCRMasterMix(2x)，美国Fermentas公司；Taq酶及PCR所需试剂，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Biowest电泳级琼脂糖，西班牙Biowest公司；Goldview?核酸染料，生工生物工程(上海)有限公司；PCR纯化试剂盒，德国Qiagen公司；DNA引物合成，北京六合华大基因科技有限公司。各试剂均在有效期内使用。
表1中国采样分布
1.3实验方法
1.3.1金黄色葡萄球菌的分离和鉴定
对采集的样品同时进行定性和定量检测，检测方法在GB.10—的基础上略做调整。将食用菌样品用无菌的剪刀剪碎，搅拌均匀后取样25g加入mL生理盐水的无菌均质袋中均质摇匀，制成1∶10的样品液，并从中取1mL加入到装有9mL10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的试管中，制成1∶的样品液，按照此方法制成1∶0的样品液。每个梯度3个平行，将样品液放置于恒温培养箱中37℃培养48h后，将每个梯度浓度的样品液分别划线于金葡菌显色板培养基上，37℃中培养24～48h。金葡菌的典型菌落在显色平板上为粉色湿润边缘平整，挑取3～4个疑似典型菌落划线于营养琼脂平板中，37℃培养(24±1)h。挑取单菌落进行血浆凝固酶实验，对其阳性菌株进行APIStaph生化鉴定，鉴定结果显示为Staphylococcusaureus，且鉴定率≥70%的，即可记为阳性。
1.3.2耐药性实验
金葡菌抗生素敏感性实验参照Kirby-Bauer法[7]进行。所有菌株经NA平板活化后加入生理盐水稀释至终浓度为1×cfu/mL，涂布于MH平板上，待菌液干后将抗生素纸片贴在培养基表面，37℃培养24h。选取目前临床上常用于治疗金葡菌感染的14类24种抗生素，其中包括：阿莫西林克拉维酸(AMC，30μg)、氨苄西林(AMP，10μg)、头孢吡肟(FEP，10μg)、头孢西丁(FOX，30μg)、青霉素(P，10μg)、头孢他啶(CAZ，30μg)、阿米卡星(AK，30μg)、庆大霉素(CN，10μg)、卡那霉素(K，30μg)、链霉素(S，25μg)、氯霉素(C，30μg)、克林霉素(DA，2μg)、红霉素(E，15μg)、泰利霉素(TEL，15μg)、环丙沙星(CIP，5μg)、诺氟沙星(NOR，10μg)、四环素(TE，30μg)，利奈唑胺(LZD，30μg)、利福平(RD，5μg)、复方新诺明(SXT，25μg)、喹奴普汀/达富普汀(QD，15μg)、替拉考宁(TEC，30μg)、呋喃妥因(F，μg)和褐霉素(FD，10μg)。StaphylococcusaureusATCC和EscherichiacoliATCC作为质控菌株。采用游标卡尺测定抑菌圈大小，精确到0.01mm。具有3种或3种以上类型抗生素抗性的菌株定义为多重耐药菌株，其中，对头孢西丁(FOX)产生耐药的菌株，初步认定为耐甲氧西林金葡菌(methicililin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，继而进行mecA/C基因检测[8-9]，确定为MRSA。对于利奈唑胺耐药的菌株，经梯度浓度稀释法(MIC法)[10-12]进行再次验证。
1.3.3肠毒素基因检测
利用PCR扩增技术检测所有金葡菌分离株的18种肠毒素基因(sea,seb,sec,sed,see,seg,seh,sei,sej,sek,sel,sem,sen,seo,sep,seq,ser,seu)。引物及扩增条件参考Varshney等[7]的方法。经PCR扩增后，取5μLPCR产物上样于1.5%琼脂糖凝胶(含Goldview染料)进行电泳分离，电压V电泳25min，利用UV凝胶成像系统(GEHealthcare，WI，USA)进行图片采集，图片保存为TIFF格式以备进一步研究。
1.3.4统计学分析
细菌的MPN值的平均计数基于basic-10logarithms方法计算。当MPN值小于0.3MPN/g时，设定值为0.15，当MPN值大于MPN/g时，则取最大值。卡方检验用于金葡菌阳性样品的污染率和污染水平的检验。所有的数据都运用SPSSV21.0软件进行分析。
2结果与分析
2.1金黄色葡萄球菌在我国食用菌中的污染情况
本次调查，从39个城市中采集份食用菌样品，检出33份金葡菌阳性样品，平均污染率为4.72%，平均污染水平9.75MPN/g，具体结果如表2。33份阳性样品分别包括金针菇18份(8.18%)，平菇3份(2.63%)，香菇4份(3.64%)，杏鲍菇4份(4.21%)，其他菇类4份(4.72%)。从污染程度来看，金针菇、平菇的平均污染水平高于10MPN/g，而香菇、杏鲍菇和其他菇类的污染水平则低于1MPN/g。39个城市中，有20个城市的食用菌检出金葡菌阳性样品，阳性率最高的城市是拉萨(15.15%，5/33)，其次为海口(12.12%，4/33)，汕头(9.09%，3/33,)，广州(6.06%，2/33)，湛江(6.06%，2/33)，北海(6.06%，2/33)，西宁(6.06%，2/33)，香港(3.03%，1/33)，厦门(3.03%，1/33)，三亚(3.03%，1/33)，郑州(3.03%，1/33)，合肥(3.03%，1/33)，西安(3.03%，1/33)，武汉(3.03%，1/33)，北京(3.03%，1/33)，上海(3.03%，1/33)，杭州(3.03%，1/33)，长春(3.03%，1/33)，哈尔滨(3.03%，1/33)，银川(3.03%，1/33)。5大类食用菌中，金针菇的污染率最高，平均污染水平相对较高。同时，金葡菌污染食用菌没有明显的地区分布规律，这暗示着食用菌在给人们提供丰富营养物质的同时，也可能带来一定的食品安全风险。
2.2食用菌源金黄色葡萄球菌的耐药性分析
本次调查，共分离出39株金葡菌阳性菌株，其中23株分离自金针菇样品，4株分离自平菇样品，4株分离自香菇样品，4株分离自杏鲍菇样品，4株分离自其他类型的食用菌样品。对39株食用菌源金葡菌均进行了耐药性实验，药敏结果如表3。我国食用菌源金葡菌分离株对22种抗生素均产生不同程度的耐药或中度耐药，对利奈唑胺、利福平敏感。22种抗生素中，耐药情况最严重的是氨苄西林和青霉素，耐药率高达92.31%，其次是红霉素(56.41%)、四环素(51.28%)、卡那霉素(46.15%)、泰利霉素(35.90%)、克林霉素(30.77%)、链霉素(25.64%)、褐霉素(20.51%)及其他(20%)。39株分离菌株中，有7株对头孢西丁产生耐药，PCR结果显示7株分离株均携带mecA基因，确定为MRSA。39株分离株中，16株对1～3种的抗生素发生耐药，16株对4～10种抗生素发生耐药，7株对10种以上的抗生素发生耐药(高度耐药)。7株高度耐药菌株中，6株为MRSA，1株为MSSA。对3类或3类以上的抗生素同时耐药的微生物，被定义为多重耐药菌。本研究中，33株(84.61%)分离株对3类或以上的抗生素发生中度耐药或耐药。由此可以看出，本研究中食用菌源分离株出现的耐药问题较为严重。值得
