ACSNANO
通过近红外至近红外上转换免疫标记技术在临床人血清中对败血症生物标志物进行无背景色谱检测
大家好，今天推荐一篇发表在ACSNANO上的文章，通讯作者为哈尔滨工业大学陈冠英教授和广州医院QiangZhou。
基于发光纳米材料的侧向流动分析（LFA）在即时检验中很有前途。但是，检测灵敏度和准确性通常受自发荧光和硝化纤维素膜和有色等离子体的光子散射干扰的影响。在这里，作者描述了近红外至近红外上转换纳米粒子（UCNP）免疫标记的LFA，用于临床人血浆中败血症生物标志物降钙素原（PCT）的无背景色谱检测。这种上转换免疫标记可在第一个生物窗口（-nm）内采用光激发（约nm）和抗斯托克斯发射（nm），从而消除了背景自发荧光以及光子散射干扰，无需复杂程序的高灵敏度检测。经过优化后，所描述的测定法的检出限降至0.03ng/mL，低于正常水平（0.05ng/mL），而检出范围为0.03–50ng/mL，涵盖了临床上的目标PCT水平（0.5–10ng/mL）。评估人血清样品的测定回收率约为95–％，而测定间和测定内系数的变化均被确定为低于15％。重要的是，临床样品中测得的PCT浓度与在大型临床环境中广泛使用的电化学发光免疫测定法（Roche）的浓度具有良好的相关性。在资源有限的临床环境中，这种近红外到近红外上转换免疫标记方法对其他血清生物标志物的超灵敏和无背景即时检测具有直接的意义。
图1基于NIR-NIRUCNP侧流法检测脓毒症生物标志物PCT的示意图
一种常用的条带结构被用来构建用于多氯三联苯检测的UCNP免疫标记LFA条带(图1)，该条带由对照(C)线和测试(T)线组成。搭建了一个便携式检测平台来采集两条线的发射信号，该平台包括一个nm的激发近红外激光器、一个检测光电池和一组光学元件。一种单克隆抗多氯三联苯抗体固定在T细胞株上，而绵羊抗兔球蛋白抗体沉积在C细胞株上，可捕获兔IgG免疫标记的UCNP。缀合物垫预载有兔IgG免疫标记的UCNP和单克隆抗多氯三联苯抗体免疫标记的UCNP(缩写为抗多氯三联苯单克隆抗体-UCNP)。将血样浸入试纸条垫后，毛细管力将血清多氯三联苯分析物沿着试纸条一直(通过T线和C线)移动到吸光度垫。在联合垫片上，多氯三联苯与抗多氯三联苯单克隆抗体-UCNP相互作用形成复合物，然后通过夹层结构被固定的捕获抗体保留在T线上。注意，T线固定的捕获抗体和抗多氯三联苯单克隆抗体-单克隆抗体-多氯三联苯复合物的单克隆抗体靶向多氯三联苯分析物的不同表位，因此，形成图1所示的夹层结构。同时，由于抗体-抗原相互作用，兔-IGg-免疫标记的UCNPs保留在C线。来自T线和C线的上转换近红外发光信号(nm)在nm激光照射下被激发，在便携式检测平台中被收集并转换成读出信号。首先通过绘制温度/碳上转换发光信号比(Y轴)(在温度或碳线的面积上积分)与已知浓度的多氯三联苯(X轴)来获得标准曲线。
图2NIR-NIRUCNPs形态特征和荧光光谱
LFA的灵敏度取决于免疫标记发光纳米材料的发光量子产率。因此，具有高量子产率的UCNPs有利于高灵敏度检测。六方钇铝石榴石氟化钠(NaYF4)是光子上转换最有效的基质材料之一，因为它的晶格声子能量低(cm-1)，可以有效地最小化镧系离子中间态的非辐射弛豫。因此，本研究选择六相NaYF4制备均匀的NaYF4:Yb/Tm核，然后将其作为种子，按照报道的具有适配的方法生长NaYF4:Yb/Tm
NaYF4core/shellUCNPs。母核(图2A,B)的平均尺寸约为24.8nm，而核/壳UCNPs的平均尺寸为49.6nm(图2D,E)。尺寸的增大加上核和核/壳纳米颗粒的均匀形状，表明惰性壳成功地生长在壳厚约12.4nm的核纳米颗粒上(图2D,E)。x射线衍射(XRD)图谱证实，制备的核和核/壳型UCNPs均为六方晶相(图2F)。惰性壳层可以使核表面钝化，并在空间上将核与周围的淬冷体隔离开来，从而提高发光量子效率。如预期的那样，nm发射处的近红外上转换发光在脱壳后增强了4倍(图2C)。图3UCNPs表面基团的表征
血液检测在水介质中检测分析物，因此需要基于纳米材料的免疫标记是水分散性的。然而，所制备的核-壳型UCNPs上的原始油酸(OA)配体是疏水的。为了使这些核/壳UCNPs水分散，然后进行配体交换程序，允许富含羧基的聚(丙烯酸)(PAA，分子量=)取代原始油酸。傅里叶变换红外(FTIR)光谱表明,表面处理后强度有明显减少的条带在和cm?1(来自?CH2)和强度的增加条带在cm?1(?C=O)。结果表明，亲水的PAA配体成功取代了疏水油酸(图3)。
图4LFA性能相关参数的优化
LFA的检测性能与试纸条的几种制备条件有关。对相关参数的系统优化有助于提高LFA的检测。作者评估了与UCNPs结合的抗体量、抗PCT-mAb-UCNP的量、测试线中捕获抗体的量、样品稀释率(样品和稀释缓冲液之间)、添加到联结垫片中的采样体积以及读出前的免疫反应时间。根据观察到的最高T/C荧光比确定最佳参数。如图4A所示，μg抗体与μL水相UCNPs结合时，T/C信号比最高。将Anti-PCT-mAb-UCNP溶液稀释后喷入联结垫片中，稀释30%(v/v)时，T/C比最高(图4B)。此外，T/C比率通常随着T线捕获抗体浓度的升高而升高(图4C)，达到2.5mg/mL。该捕获抗体浓度被用作制备测试条的最佳浓度。向血清中加入不同体积量的缓冲液，以产生优化的检测性能，在7:3(体积/体积)的最佳稀释比(血清/缓冲液)下测定最高的温度/温度(图4D)。然后，稀释的血清浸入样品垫的最佳体积被确定为μL(图4E)，而免疫标记时间(或测试时间)被确定为约15分钟(图4F)。在这项工作中，这些优化的参数被用于基于近红外到近红外的LFA统一通信网络。
图5基于NIR-NIRUCNP的LFA分析性能
使用所述LFA分析了一组已知PCT浓度为0-50ng/ml的临床样本。每个样品分析一式三份。实验结果表明，T/C(Y)和PCT浓度(X)之间有很好的相关性，符合Y=50.12/[0.01+(X/.46)]+0.04(R2=0.99)的方程(图5A)。空白限(LoB)、检测限(LoD)和定量限(LoQ)分别确定为0.02、0.03和0.05纳克/毫升(图5B)。重要的是，使用近红外-近红外上转换LFA测量的PCT浓度与商业化罗氏电化学发光免疫分析的浓度呈良好的线性相关性(图5C)。这些分析结果表明，基于近红外-近红外光谱的LFA可用于快速和高灵敏度的PCT检测。
图6有色等离子体的自发荧光和吸收光谱
市场上常见的荧光LFA包括铕(ⅲ)螯合物PS-CdSSe/ZnS量子点。这些LFAs的发射波长在nm以下，在这个波长下，有色等离子体和NC膜的吸光性很大。在临床血浆或血清样本中，高胆红素血症(HB)和溶血血浆(HP)比正常血浆(NP)和高脂血症(HL)有更高的光吸收(图6A)。在nm光激发下，可见区可以观察到NP、HL、HB和HP的高自发荧光(图6B)，这通常用于铕(III)螯合PS和CdSSe/ZnSqd基LFAs中。在UCNP激发的nm(图6C,D)下，没有看到自发荧光(~nm和~0nm)。所有类型的血液样本在nm处都有较低的光吸收，其中NIR-NIR上转换发光峰(图6A)。
图7有色等离子体中荧光材料的光谱
因此，有色血液样品对CdSSe/ZnS量子点的可见荧光(图7A)和铕(III)螯合物PS(图7B)产生了明显的不利影响，并对NaYF4:Yb，Er
NaLuF4UCNPs的绿色上转换(图7C)和NaYF4:Yb，TmNaYF4UCNPs的蓝色上转换(图7D)产生了明显的不利影响，这些上转换以前用于LFA(图7D)。相比之下，有色血液样本(中性粒细胞、血红蛋白和幽门螺杆菌)对近红外到近红外上转换产生了近乎零的影响，而高密度脂蛋白引起了近红外到近红外上转换的轻微下降(图7D)，这可能是由于其在nm激发光的高光子散射。受溶液中荧光结果的鼓舞，作者进一步评估了基于ps和CdSSe/ZnS量子点的铕(III)螯合物、基于绿色发光UCNP和基于NIR-NIRUCNP的LFA的抗干扰能力。图8有色等离子体对LFA条带荧光强度的影响
添加HB或HP后，观察到铕(III)螯合PS-和CdSSe/ZnSqd基LFA的发射信号下降，而添加HP后，绿色发射UCNP基LFA的发射信号下降(图8A,B)。与此形成鲜明对比的是，基于近红外-近红外UCNP的LFA发射信号在所有血型下都保持不变(图8B)，有望在临床实践中用于疾病生物标志物的准确评估。事实上，临床溶血性、高胆红素和高脂血浆对多氯三联苯检测没有明显影响。当用NC膜(标记为封闭)覆盖LFA带(标记为模拟)时，来自基于NIRto-NIRUCNP的LFA的发射信号保留最多，因为与来自铕(III)螯合物PS、CdSSe/ZnS量子点和绿色发射UCNP的可见光相比，NIR光子在NC膜中具有更低的光散射和吸收率(图8C，D)。这一特性提高了基于近红外到近红外光谱的LFA仪器的灵敏度，减少了数控膜和有色血液样品的干扰。
总之，作者开发了一种近红外到近红外上转换免疫标记LFA，其具有用于基于蛋白质的生物标志物检测的便携式读取器，避免了在传统的基于荧光纳米材料的LFA中常见的自体荧光和光散射的不利干扰，能够对不同类型(高胆红素血症、溶血性血浆、正常血浆和高脂血症)的临床血浆中的PCT生物标志物进行高灵敏度和高准确度的检测。所描述的近红外-近红外上转换免疫标记方法有望以高灵敏度和高精度用于血清生物标志物的现场检测，特别是在资源有限的临床环境中。
本文作者：ZC
DOI:10./acsnano.0c05
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